17-18 (Media دانشگاه گیالن دانشکده علوم کشاورزی ازدیاد نباتات )فصل هفدهم( ریزازدیادی و کشت بافتهای گیاهی )آماده سازی و ترکیب محیط کشت( Chapters 1 سال تحصیلی 1393-94 زکی زاده مواد تشکیل دهنده محیط کشت نیازهای غذایی اولیه سلولهای گیاهی با گیاه کامل شباهت زیادی دارد. عناصر غذایی برای رشد و نمو گیاه ضروری است و بدون آب و عناصر غذایی معدنی گیاه تحت هیچ یک از شرایط این ویترو یا این ویوو قادر به ادامه حیات نیست. به طور کلی محیط کشت بافت گیاهی از مواد زیر تشکیل شده است: عناصر پرمصرف یا بزرگ عنصرها S( )N, P, K, Ca, Mg, عناصر کم مصرف یا ریز عنصرها Mo( )Fe, Mn, Zn,,B Cu, ویتامین ها قندها )ساکارز گلوکز فروکتوز و...( و برخی از مواد آلی ناشناخته تنظیم کننده های رشد ABA( )NAA, IAA, IBA, 2,4-D, BAP, 2iP, Kinetin, TDZ, GA3, اسیدهای آمینه و دیگر مواد نیتروژن دار مواد جامدکننده محیط کشت )آگار ژل رایت فیتاژل و...( Chapters 2 (Zakizadeh55@yahoo.com) 1
17-18 (Media انواع محیط کشت معموال چندین دستور یا پروتکل تهیه محیط کشت برای بیشتر کارهای کشت بافت و سلول مورد استفاده قرار می گیرد مانند محیطهای کشت: موراشیگ و اسکوگ یا )Murashige & Skoog( MS وایت )White( گمبورگ و همکاران یا )Gamborg et al.( B 5 شنک و هیلدربرانت یا )Schenk & Hilderbrandt( SH نیچ و نیچ Nitsch( )Nitsch & کویرین و لپویور یا )Quoirin & Lepoivre( QL که از میان آنها معروفترین و پراستفاده ترین محیط کشت محیط موراشیگ و اسکوگ است که به محیط MS معروف است. Chapters 3 عناصر پرمصرف )Macronutrients( عناصر پرمصرف شامل شش عنصر اصلی نیتروژن )Ca( منیزیم )Mg( و گوگرد )S( می باشند. )N( فسفر )P( پتاسیم )K( کلسیم غلظت بهینه هر ماده برای حداکثر رشد بین گونه های گیاهی مختلف متفاوت است. سلولها می توانند بر روی نیترات ها به تنهایی رشد کنند ولی هنگامی که محیط کشت دارای منبع نیتروژنی نیترات و آمونیوم باشد نتایج کامال بهتری به دست می آید. برای رشد بیشتر گونه های گیاهی پتاسیم مورد نیاز است. اغلب محیط کشت ها دارای پتاسیم به صورت نیترات و کلرید هستند. غلظت بهینه فسفر منیزیم گوگرد و کلسیم از یک تا ۳ میلی گرم در لیتر است. Chapters 4 (Zakizadeh55@yahoo.com) 2
17-18 (Media عناصر کم مصرف )Micronutrients( عناصر کم مصرف اصلی برای کشت بافت و سلول شامل آهن )Fe( منگنز )Mn( روی )Zn( بر )B( مس )Cu( و مولیبدن )Mo( می باشد. آهن ممکن است مهمترین عنصر کم مصرف باشد. آهن معموال به شکل کالت استفاده می شود. کالت آهن به دو صورت زیر استفاده می شود: EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acetic acid EDDHA: Ethylene Diamine Di-2-Hydroxyphenyl Acetate نوع دوم )EDDHA( تحرک بیشتری در گیاه دارد و بنابراین برای گیاهان حساس به کمبود آهن مناسب تر از نوع اول است. این نوع محیط کشت را قرمز می کند. کبالت )Co( ید )I( سدیم )Na( و کلر )Cl( نیز در برخی محیط کشت ها بکار می روند. Chapters 5 ترکیبات مورد استفاده برای تأمین عناصر پرمصرف و کم مصرف در محیط MS Macronutrients NH 4 NO 3 KNO 3 CaCl 2. 2H 2 O MgSO 4. 7H 2 O KH 2 PO 4 Micronutrients MnSO 4. H 2 O ZnSO 4. 7H 2 O CuSO 4. 5H 2 O Na 2 MoO 4. 2H 2 O H 3 BO 3 Na-Fe- EDTA CoCl 2. 6H 2 O KI 6 (Zakizadeh55@yahoo.com) 3
17-18 (Media مقادیر نمکهای مورد نیاز برای تهیه محلولهای پایه ماکرو و میکرو در محیط MS 7 محیط کشت SH 8 (Zakizadeh55@yahoo.com) 4
17-18 (Media محیط کشت QL 9 کربن و منبع انرژی کربوهیدرات جزء بسیار مهمی در هر محیط کشت است و چون معموال شرایط رشد برای فتوسنتز کافی نیست و یا به علت تاریکی فتوسنتز انجام نمی شود اضافه کردن کربوهیدرات به محیط کشت ضروری است. بافتهای سبز در شرایط این ویترو به قدر کافی اتوتروف نیستند. غلظت CO 2 نیز می تواند محدود کننده باشد. از میان کربوهیدراتهایی که در محیط کشت بکار می روند ساکارز ترجیح داده می شود. زیرا این قند به وسیله گیاه سنتز شده و به صورت طبیعی در گیاه منتقل می شود. گلوکز و فروکتوز نیز در برخی موارد می توانند جایگزین شوند. گلوکز به اندازه ساکارز مؤثر است ولی فروکتوز اثر کمتری دارد. الکتوز گاالکتوز رافینوز مالتوز و نشاسته نیز بررسی شده اند اما همگی اثر کمتری از ساکارز و گلوکز دارند. Chapters 10 (Zakizadeh55@yahoo.com) 5
17-18 (Media کربن و منبع انرژی )ادامه...( غلظت ساکارز در محیط کشت در حالت عادی بین ۲ تا ۳ درصد است. البته ممکن است بین یک تا ۵ درصد هم استفاده شود. غلظت قند انتخاب شده بستگی زیادی به نوع و سن مواد در حال رشد بسیار جوان به غلظت نسبتا باالیی از قند نیاز دارند. دارد. مثال جنینهای معموال با افزایش غلظت قند رشد و نمو افزایش می یابد تا وقتی به حد بهینه برسد. می توان از قند معمولی که در بازار موجود است نیز استفاده کرد. ساکارز موجود در محیط کشت به سرعت به گلوکز و فروکتوز شکسته می شود. ابتدا گلوکز و سپس فروکتوز به مصرف سلولها می رسند. هنگام اتوکالو کردن محیط کشت مقداری از ساکارز هیدرولیز می شود. Chapters 11 ویتامین ها گیاهانی که در حالت عادی رشد می کنند ویتامینهای مورد نیاز خود را تأمین می کنند. در صورت رشد سلولها و بافتهای گیاهان به صورت درون شیشه ای برخی از ویتامینها ممکن است عامل محدود کننده برای رشد شوند. ویتامینهایی که بیشتر در محیط کشت بافت و سلول بکار می روند شامل موارد زیرند: تیامین یا آدنوزین ( 1 B( نیکوتینیک اسید یا نیاسین )PP( پیریدوکسین یا آدرمین ( 6 B( تیامین ویتامینی است که در اصل برای رشد تمام سلولها الزم است و در غلظتی بین ۰/۱ تا ۱۰ میلی گرم در لیتر بکار می رود. ویتامین های دیگر مانند بیوتین )H( فولیک اسید )M( آسکوربیک اسید )C( پانتوتنیک اسید یا کلسیم پانتوتنات توکوفرول )E( ریبوفالوین یا الکتوفالوین ( 2 B( و پی آمینوبنزوئیک اسید نیز در برخی کشتهای سلولی بکار می رود. ویتامین ث )C( در غلظت باال به عنوان آنتی اکسیدان بکار می رود. 12 (Zakizadeh55@yahoo.com) 6
17-18 (Media ویتامین ها )ادامه...( میواینوزیتول )اینوزیتول یا مزواینوزیتول( نیز به طور معمول در بسیاری از محلول های ویتامین دار استفاده می شود. با آنکه میواینوزیتول یک کربوهیدرات است نه یک ویتامین نشان داده شده است که رشد را در بسیاری از کشتهای سلولی تحریک می کند. وجود میواینوزیتول در محیط کشت الزامی نیست ولی در مقادیر کم رشد را در بیشتر گونه ها تحریک می کند. میواینوزیتول معموال به میزان ۱۰۰ میلی گرم در لیتر در محیط کشت بکار می رود. اسیدهای آمینه و سایر افزودنی های نیتروژن دار سلولهای کشت شده به طور عادی قادر به سنتز تمام آمینواسیدهای مورد نیاز خود هستند. با اینحال افزودن برخی آمینواسیدها می تواند رشد سلولها را افزایش دهد. آمینواسیدها منبع نیتروژن قابل استفاده ای را در اختیار سلولهای گیاهی قرار می دهند که می تواند سریعتر از نیتروژن معدنی جذب سلولها شود. یکی از این آمینواسیدها گالیسین شود. )Glycine( است که در ترکیب ویتامینها قرار داده می 13 افزودنی های آلی نامشخص افزودنی هایی که مورد آزمون قرار گرفته اند عبارتند از: پروتئین های هیدرولیز شده شیر نارگیل milk( )Coconut عصاره مخمر ( Yeast )extract عصاره مالت موز آسیاب شده powder( )Banana آب پرتقال آب گوجه فرنگی آب انگور آب آناناس شیره درخت غان و.... در مواقع تحقیقات نباید از این مواد استفاده شود زیرا: ترکیب آنها تقریبا یا کامال ناشناخته است. ترکیب آنها خیلی متغیر است. مثال شیر نارگیل هم بین نارگیلهای جوان و پیر متفاوت است و هم بین نارگیلهای همسن. 14 (Zakizadeh55@yahoo.com) 7
17-18 (Media ذغال فعال شده )Activated charcoal( ذغال فعال از سوختن چوب در حرارت باال و در حضور بخار تولید می شود. این ماده دارای شبکه های زیادی از منافذ با سطح داخلی بزرگ است که تمام مواد می توانند جذب آن شوند. به منظور خارج ساختن هرگونه ناخالصی ذغال فعال را خالص می کنند. ذغال فعال شده به غلظت نیم تا ۳ درصد به محیط کشت اضافه می شود. اثر ذغال فعال شده عموما به یکی از سه عامل زیر مربوط است: جذب ترکیبات بازدارنده ]مانند ترکیبات سمی فنولیکی[ جذب تنظیم کننده های رشد از محیط کشت Kinetin[ ]NAA, IAA, BAP, 2iP, تیره کردن محیط کشت ]می تواند تشکیل ریشه و رشد را تحت تأثیر قرار دهد[ 15 مواد جامد کننده یا سیستمهای حمایت کننده آگار )Agar( معمولی ترین ماده ژل مانند است که برای تهیه محیط های کشت جامد و نیمه جامد کشت بافت بکار می رود. هنگام آمیخته شدن آگار با آب ژلی تولید می شود که در دمای حدود 6۰ تا ۱۰۰ درجه سانتیگراد ذوب شده و در دمای حدود 4۵ درجه سانتیگراد جامد می شود. بنابراین ژل آگار با تمام دماهای نگهداری سازگاری دارد. همچنین آگار واکنشی با مواد تشکیل دهنده محیط کشت ندارد و توسط آنزیمهای گیاهی جذب نمی شود. سفتی ژل آگار بستگی به غلظت و نوع آگار مورد استفاده و ph محیط کشت دارد. آگار معموال در غلظتهای بین ۰/۵ تا ۱ درصد بکار می رود. آگاری که ما در آزمایشگاه استفاده می کنیم به میزان ۰/8 درصد یا همان 8 گرم در لیتر محیط کشت استفاده می شود. نشان داده شده است که افزودن ۰/8 تا ۱ درصد ذغال فعال به محیط کشت سفتی ژل آگار را کاهش می دهد. 16 (Zakizadeh55@yahoo.com) 8
17-18 (Media مواد جامد کننده یا سیستمهای حمایت کننده )ادامه...( ژالتین به غلظت ۱۰ درصد به عنوان ماده ژل مانند در محیطهای کشت بکار برده شده است اما مفید نیست زیرا در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد ذوب می شود. دیگر مواد ژل مانند مورد استفاده ژل رایت )Gelrite( و فیتاژل )Phytagel( می باشند. این مواد سنتز شده هستند و به میزان ۱/۲۵ تا ۲/۵ گرم در لیتر بکار می روند. )ژلرایت شرکت دوچفا به میزان ۳ گرم در لیتر بکار می رود(. این مواد ژل های روشن و شفافی ایجاد می کنند که به تشخیص آلودگی کمک می کند. به جای استفاده از مواد جامد کننده می توان از مواد زیر برای نگهداشتن ریزنمونه روی محیط کشت استفاده کرد: سلوفان سوراخدار پل کاغذ صافی فتیله کاغذ صافی اسفنج پلی اورتان پشم پلی استر و... 17 مقادیر مورد نیاز آهن ویتامین ساکارز آگار و... 18 (Zakizadeh55@yahoo.com) 9
17-18 (Media تنظیم کننده های رشد گیاهی تفاوت هورمونهای گیاهی و تنظیم کننده های رشد گیاهی: )Plant growth regulators( هورمونهای گیاهی hormones( Plant یا :)Phytohormones مواد آلی هستند که توسط گیاهان تولید شده و در غلظتهای کم فرایندهای فیزیولوژیکی را تنظیم می کنند. تنظیم کننده های رشد گیاهی regulators( :)Plant growth ترکیبات سنتز شده و یا هورمونهای گیاهی هستند که فرایندهای فیزیولوژیکی را ]توسط تقلید از هورمونها تأثیر روی سنتز هورمونها از بین بردن و یا تغییر محل تأثیر هورمونی[ تنظیم می کنند. چهار گروه تنظیم کننده رشد در کشت بافت گیاهی از اهمیت برخوردارند: اکسین ها سایتوکاینین ها جیبرلین ها و آبسایسیک اسید. نسبت اکسین به سایتوکاینین نوع و میزان اندام زایی را در کشت سلولهای گیاهی تعیین می کند. بین جنس ها گونه ها و حتی ارقام از نظر نوع و میزان اکسین و سایتوکاینین مورد نیاز برای ریخت زایی تفاوت قابل توجهی وجود دارد. 19 آکسین ها )Auxins( اثرات مختلف اکسین ها: رشد ساقه تشکیل ریشه نابجا جلوگیری از رشد جوانه های جانبی ریزش برگها و میوه ها فعال کردن سلولهای الیه زاینده. بطور کلی اکسین ها در محیط کشت بکار می رود تا تولید کالوس و رشد سلول را تحریک کرده موجب آغازیدن شاخساره و به ویژه ریشه شده و رویان زایی بدنی و رشد نوک شاخساره را تحریک نمایند. ایندول- ۳ -استیک اسید )IAA( به عنوان ترکیب طبیعی که اثر اکسینی باالیی دارد شناخته شده است. ایندول بوتیریک اسید )IBA( و نفتالن استیک اسید )NAA( ترکیبات سنتزی هستند که اثر قوی تری از IAA روی ریشه زایی دارند. امروزه IBA و NAA هنوز مورد استفاده ترین اکسین ها برای تولید ریشه در قلمه های ساقه )خارج از کشت بافت( و ریزقلمه های تولید شده توسط کشت بافت می باشند. 20 (Zakizadeh55@yahoo.com) 10
17-18 (Media معموال گیاهانی که اکسین درونی باالیی دارند سهل ریشه زا هستند. D-2,4 نیز نوعی اکسین مصنوعی است که قدرت بیشتری از ۳ اکسین دیگر دارد و به عنوان علف کش استفاده می گردد. افزایش قدرت اکسین ها به صورت زیر است: 2,4-D > NAA > IBA > IAA از بین اینها IBA بیشتر از بقیه برای ریشه زایی استفاده می گردد. گاهی IBA IAA و NAA با هم استفاده می شوند. IAA به تجزیه در مقابل نور حساس است و باید در ظروف تیره ذخیره گردد. اکسین های سنتز شده دیگر مورد استفاده در کشت بافت: -4 کلروفنوکسی استیک اسید CPA( )4-۲ -۵ 4 کلروفنوکسی استیک اسید T( )2,4,5- دی کامبا )Dicamba( و پیکلورام )Picloram( 21 سایتوکاینین ها بیشترین اثر را در آغازش جوانه و شاخه از قلمه های برگی و در سیستمهای کشت بافت دارند. سایتوکاینین های طبیعی و مصنوعی عبارتند از: زآتین )Zeatin( زآتین ریبوزاید کاینتین )Kinetin( ایزوپنتنیل آدنین یا دی اتیل آمینو پیورین )2iP( تیدیازورون )TDZ( و بنزیل آدنین یا بنزیل آمینوپیورین BA(.)BAP or سایتوکاینین ها )Cytokinins( زآتین و 2iP به عنوان سایتوکاینین های طبیعی و BAP و کاینتین سایتوکاینین های سنتز شده می باشد. بطور کلی افزودن سایتوکاینین ها به محیط کشت موجب ترغیب تقسیم سلولی تشکیل شاخساره و پرآوری شاخساره جانبی است و از تشکیل ریشه جلوگیری می کند. 22 (Zakizadeh55@yahoo.com) 11
17-18 (Media نوع ریخت زایی که در یک کشت بافت گیاهی اتفاق می افتد عمدتا به نسبت غلظت اکسین ها و سایتوکاینین های موجود در محیط کشت بستگی دارد. به طور کلی: سایتوکاینین ها )ادامه...( نسبت باالی اکسین به سایتوکاینین باعث آغازش ریشه نابجا )initiation رویان زایی )Embryogenesis( و آغازش پینه یا کالوس می شود. Adventitious root ( )Callus initiation( همچنین نسبت پایین آنها باعث تولید شاخساره نابجا می شود ]بسته به نوع گیاه و شرایط فیزیولوژیکی آن[. گیاهانی که سایتوکاینین داخلی باالیی دارند مشکل تر از بقیه ریشه دار می شوند. معموال کاربرد سایتوکاینین های مصنوعی در روی قلمه های ساقه از ریشه زایی جلوگیری می کند. 23 جیبرلین ها )Gibberellins- GA( معموال نیازی به افزودن آن به محیط کشت نیست گرچه برخی گونه های گیاهی ممکن است به آن نیاز داشته باشند. بطور کلی افزودن GA 3 به محیط کشت برای ترغیب رشد در کشتهای سلولی کم تراکم افزایش رشد کالوس و طویل کردن گیاهچه های کوتاه مانده است. آبسایسیک اسید معموال نیازی به افزودن آن به محیط کشت نیست. )Abscisic Acid- ABA( افزودن ABA به محیط کشت عموما به منظور ممانعت از رشد کالوس یا ترغیب آن بر حسب گونه گیاهی افزایش پرآوری شاخساره یا جوانه و جلوگیری از مراحل آخر نمو رویان است. 24 (Zakizadeh55@yahoo.com) 12
17-18 (Media تهیه محلولهای پایه یا ذخیره solutions( )Stock استفاده از محلولهای ذخیره شمار عملیات تکراری در تهیه محیط کشت را کاهش می دهد و بنابراین احتمال خطای انسانی یا آزمایشی را کم می کند. همچنین توزین مستقیم برخی مواد مورد نیاز برای تهیه محیط کشت که در مقادیر بسیار کم استفاده می شوند غیر ممکن یا بسیار مشکل است. روش تهیه محلولهای پایه در کالس عملی توضیح داده می شود. معموال محلولهای پایه عناصر پرمصرف با ۱۰ یا ۲۰ برابر غلظت عناصر کم مصرف با ۱۰۰ تا ۱۰۰۰ برابر غلظت ویتامینها با ۱۰۰ تا ۱۰۰۰ برابر غلظت و آهن با ۱۰۰ یا ۲۰۰ برابر غلظت تهیه می شوند. محلولهای ذخیره تنظیم کننده های رشد نیز معموال به غلظت یک میلی گرم در میلی لیتر یا همان ۱۰۰۰ پی پی ام تهیه می شود و در فریزر نگهداری می شود. 25 (Zakizadeh55@yahoo.com) 13